PCR-3 PCR ÇEŞİTLERİ

PCR-3 PCR ÇEŞİTLERİ

Daha önceki serilerde temeline değindiğimiz PCR’ın istenilen veriye yönelik optimizasyonu ile nasıl çeşitlendiğine ve bu çeşitlerin neler olduğuna değinmeye çalışacağız. Değinmeye çalışacağız dememizin sebebi bu yazı kaleme alınırken dahi PCR tabanlı pek çok teknik daha literatüre kazandırılıyor olabilir.

PCR çeşitleri kullanılan target (hedef) materyale ve yapılacak analize göre şekillenmektedir. Klonlama, dizi analizleri, genetik tiplendirme gibi amaçlarla farklı PCR çeşitleri tercih edilmektedir. Özellikle klinik çalışmalarda hastalıkların teşhisinde ya da tanısında kullanılabilecek biyobelirteçlerin geliştirilmesinde, transkriptomik analizler ile gen ekspresyon düzeylerinin araştırılmasında sıkça tercih edilen PCR çeşitleri vardır. Bunların başında da RT- PCR, sıkça duyduğumuz adıyla ‘Gerçek Zamanlı PCR’ gelmektedir.

Nicel/Kantitatif PCR (qPCR), gen ifadesinin doğru analizi için güçlü bir tekniktir. Düşünüldüğünde bir organizmanın çekirdeği olan tüm hücrelerinde aynı DNA molekülü bulunmaktadır. Örneğin bir insanın farklı hücrelerinden elde edilen DNA’ları ile PCR yaparsak reaksiyon sonucu elde edeceğimiz ürünler aynı olacaktır (mutasyon taraması yapılmayacak ise). Bu nedenle bir genin o hücreden ne kadar eksprese edildiğini öğrenmek istiyorsak o geni defalarca çoğaltmak yerine o genin ürünlerine bakmalıyız. Kısacası o genin ürünü olan proteine ya da proteinin translasyonunu sağlayacak olan mRNA’ya.

PCR temel olarak iki zincirli DNA’nın farklı evrelerde farklı sıcaklık değişimleriyle çoğaltılmasına dayalı bir yöntemdir. qPCR ile bir genin ifadesini ölçmek için bizler mRNA’ya odaklanırız. Fakat single stranded yapıdaki mRNA PCR reaksiyonu için uygun bir materyal değildir. İşte bu aşamada mRNA’dan revers traskripsiyon (geri yazılım) ile tamamlayıcı DNA (Complementary DNA- cDNA) sentezi yapılır. Bu aşamada farklı kaynaklardan elde edilmiş revers transkriptaz enzimleri kullanılabilir. Bunlara örnek olarak AVM (Avian Myeloblastosis Virus) ve MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) revers transkriptazları verilebilir.

qRT-PCR’da geri transkripsiyon ile elde edilen cDNA sentezini, cDNA’nın standart PCR yoluyla çoğaltılması takip eder (Two Step). Bu sayede geleneksel PCR yöntemi ve gen analizi birleştirilmiştir olur. PCR çoğaltımını görünür hale getiren ve monitorize edebilen floresan işaretli prob ve boyaların kullanıldığı, floresanın oluşan DNA ile doğru orantılı olarak arttığı bir çoğaltma yöntemi elde edilmiş olur. Birçok isimlendirilmesi yapılan bu teknoloji “kinetik PCR”, “homojen PCR”, “kantitatif Real-time PCR” gibi çesitli adlarla da isimlendirilmektedir. RT-PCR iki basamaktan olabileceği gibi tek aşamalı bir reaksiyonla da gerçekleşebilir (One Step). T. Thermophilus (Tth) DNA Polimeraz gibi bazı polimerazlar Mn+2 varlığında hem RNA hem DNA kalıp ipliklerini kullanarak ilgili gen bölgesini aynı tüpte tek aşamada çoğaltabilir. Ya da bazı özel geliştirilen kitler ile Revers Transkriptaz ve DNA Polimeraz aynı anda mix’e ilave edilerek One Step RT-PCR gerçekleştirilebilir. Real time PCR, nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresans sinyalin ölçülmesi ile kısa sürede, kantitatif sonuç veren bir PCR yöntemi. Her kuyucuğa öncelikle florasan ışık gönderilir ve geri gelen ışıma toplanır. 

RT-PCR reaksiyonuna eklenen kemilüminesans maddelerle döngüler (cycle) sırasında ve döngüler devam ederken ortaya çıkan ürünler gerçek/eş zamanlı izlenebilir, analiz için değerlendirmeye alınabilir. Bugün birçok araştırma ve tanı laboratuvarlarında kullanılan real- time PCR cihazları mevcuttur. Bu cihazlar birbirlerinden reaksiyon sayısı kapasiteleri, eksitasyon-emisyon dalga boylarındaki farklılıkları, hızları ve kanal sayıları ile ayrılırlar.

Ticari olarak satılanlar; “Stratagene M x 3000p, M x 3005p, M x 4000”, “Applied Biosystems 7300 ve 7500”, “Chromo4”, “Smart Cycler”, “Rotor-Gene”, “LightCycler” en fazla kullanılanlardır.

RT-PCR bize her döngüde ilgili genin yaydığı ışıma miktarını dedekte ederek logaritmik artışı ile ilişkili bir grafik verir. Threshold değeri eşik algılama noktasıdır. Cycle Threshold (Ct) ise örneğin eşik yani threshold’u aştığı ilk cycle’dır. Kısacası Ct değeri, ilgili ışımada önemli artışın olduğu ilk cycle’ı ifade eder. Ct değeri aynı zamanda ışıma ile alınan logaritmik artışın (2n) orta noktasıdır. RT-PCR cihazı girilen döngü sayısına göre bu değeri kendisi optimize etmektedir. Ct ile gen ifadesi arasında ters orantı vardır. Ct değeri ne kadar büyükse genin ifadesi o kadar azdır (down regulation).

RT-PCR’da floresan tespit metotlarına baktığımızda özgün ve özgün olmayan tespit yöntemleri ile karşılaşmaktayız. Özgün olmayan tespit yöntemlerinin başında Sybr Green gelmektedir. Spesifik olmayan çift zincirli DNA’nın çoğaltımında “SYBR Green I” yöntemi kullanılır. Bu yöntemde kullanılan floresan boya sadece dsDNA (çift zincirli DNA)’ya bağlandığından çoğalan DNA miktarındaki artışa paralel olarak “real-time” PCR cihazında okunan floresanın miktarı da eş zamanlı olarak artar. “SYBR Green I” en fazla kullanılan boya çesitidir ve 497 nm dalga boyunda yükseltgenir ve 520 nm dalga boyunda indirgenir. Çift sarmal DNA’nın küçük oluğuna bağlanan boya 30 amplifikasyon döngüsü sonrası yalnızca aktivitesinin %6’sını kaybeder. Çoğaltımın başında reaksiyon karışımında çift zincirli DNA molekülü, primerler ve “SYBR Green I” boyası bulunmaktadır. Bağlı olmayan serbest DNA molekülü çok az bir floresan ısıma yapar. Primerler bağlanıp uzama başladığında boya molekülü çift zincirli DNA’nın arasına girer ve floresan yayılımı baslar. Başlangıçtaki döngü boyunca sinyal zayıftır; ürün miktarı arttıkça floresan miktarı hızla artar ve bu artış “real-time” cihazının monitöründen izlenebilir. SYBR Green optimize edilmiş PCR şartlarında ve dizaynı iyi yapılmıs primerler ile çok fazla sayıda hedef genin çoğaltılmasına olanak verir. Floresan işaretli problara ihtiyaç göstermediği için maliyeti ucuzdur. Bunun yanı sıra yöntemin dezavantajları da vardır. İstenmeyen PCR ürünlerin çoğalması ile yine floresan ışıma açığa çıkabilir, bu durumda istediğimiz DNA’nın çoğaldığını işaret etmez ve yanlış pozitif sonuç alınabilir. Bağlı olmayan serbest DNA molekülü çok az bir floresan ısıma yapar. SYBR Green bu dsDNA’nın minör oluklarına bağlanmış olabilir.

Ortamda hedef DNA dizisi olmadığında primerlerin birbiri ile bağlanmaları sonucunda “primer dimer”leri olarak adlandırılan ve çift zincirli DNA bölgelerinin oluşumu ile floresan ısıma gözlenebilir. (Bu durumun negatif kontrolde Ct değeri alınmasıyla da ilgisi vardır.) Sybr Green yönteminde çoğaltılan DNA’nın istenilen hedef bölge olup olmadığını anlayabilmek için DNA’ların erime eğrisi analizleri (“melting curve”, “dissociation”) yapılması gerekmektedir. Erime eğrisi analizi yapılmak istendiğinde cihaz PCR tüplerini yavasça ısıtmaya baslar. Çift zincirli DNA birbirinden ayrılmaya başladığında (melting temperature= Tm) floresan boya serbest kalır ve okunan floresan miktarı da düşer. Her bir DNA’nın belirli bir erime sıcaklığı (Tm) derecesi vardır. Bu erime sıcaklığı çoğalan DNA parçalarının uzunluğuna ve içerdiği GC/AT oranına bağlıdır. Spesifik olmayan ürünlerin çoğalmasında (primer dimer’leri de dahil) aradığımız DNA parçasının Tm derecesi arasında farklılık olacaktır. Tm sıcaklığı her ürün için spesifiktir.

Tm derecesinin farklı olması her ürünün kendine özgü uzunluğu ve gen dizisi içermesi anlamına gelir ki biz aynı gen bölgesinden bahsediyorsak böyle bir durumla karşılaşmamamız gerekir. Bu yöntemle sadece non-spesifik bağlanmalar değil ayrıca bilinmeyen iki DNA dizisi karşılaştırılmak istendiğinde yöntem güvenilir bir şekilde kullanılabilir.

Özgül Belirleme Sistemlerine baktığımızda DNA parçasının çoğaltılmak istenilen bölgesi özel bir bölge ise bu bölgenin saptanmasında floresan isaretli problar kullanılır. Bu tekniklerin basında “TaqMan” prob, “Molecular beacon”, “Light-up” prob, hibridizasyon prob ve “Scorpion” primer gibi floresan isaretli problar gelmektedir.

“TaqMan® probe” yöntemi “Double-Dye Oligonucleotide”, “dual labeled probe” veya “5’nuclease probe” olarak da adlandırılmaktadır. Çoğaltılma sırasında hedef nükleik asit dizisi üzerinde primerler bağlanma bölgeleri arasında “TaqMan” problar bağlanırlar. Primerlerin bağlanmasının ardından yeni zincir oluşmaya başlar. Probun bağlı olduğu bölgeye gelindiğinde Taq DNA polimeraz enzimi 5’→3 nükleaz aktivitesi ile FAM’ı probdan ayırır. Serbest hale geçen FAM sinyal oluşturur. DNA zincir sentezi uzamaya devam eder. 3’ uçtaki baskılayıcı TAMRA boyası 5′ uçtaki FAM boyasının sinyal oluşturmasını engellemektedir. Prob hedef DNA’ya bağlanma durumunda bile floresan sinyal ölçümü düşüktür. Nitekim her bir döngüde ürün çoğaltımı arttıkça floresan da ona bağlı olarak artmaya devam eder.

TagMan® probe yönteminde mutasyon tespiti ile birlikte sayısal değerlere de ulaşılabildiğinden araştırıcılar için avantaj sağlar. Bu yöntem standart protokolü, kolay dizaynı ve çok az bir optimizasyonla gerçekleştiği için hem alel diskriminasyon ile mutant alel oranının belirlenmesinde hem de ekspresyon profilinin çıkartılmasında kolaylıkla kullanılır.

Moleküler Boncuk Yöntemi hem yapısı hem de çalısma prensibi olarak “TagMan® probe” ve “SYBR Green I” yönteminden çok farklıdır. Saç Tokası şeklindeki yapının yuvarlak uç kısmı çoğaltılacak DNA ile komplementer tek zincirli DNA dizisini içerir. Bu yapının düz olan uç kısımlarında 2 adet florokrom boya bulunur. Bunlardan baskılayıcı/söndürücü (Q) florofor (F) boyanın floresansını engeller. Moleküler boncuk probu solüsyon içerisinde serbest halde iken ısıma yapmaz. (Düşük sıcaklıkta rastgale sarmal konformasyon olsa dahi Q’nun F’e yakınlığı ışımayı söndürür.) Çoğaltılmak istenilen DNA bölgesi PCR ile çoğaltılması planlandığında prob hedef DNA dizisine göre dizayn edildiğinden birbirleri ile karşılaştıklarında konformasyonu değişir ve düz, tek zincirli hale geçer. Çünkü bu yapı termodinamik olarak saç tokası seklinden daha kararlıdır. Moleküler boncuk, hedef nükleik asit dizisi ile hibridize olur olmaz boncuk molekülünün yapısı değiştiğinden ve boyalarda birbirlerinden uzaklaştığından floresan miktarı artar. Bu teknikte yine oluşan floresanın ölçümüne dayanmaktadır.

Moleküler boncuk yönteminin en fazla kullanıldığı alanlar; genetik tarama, SNP çalısmaları, farmakogenetik çalısmalardır. Bu yöntemde prob dizaynı çok önemlidir ve optimal sartlar sağlanmadığında özellikle uygun sıcaklık bulunamamışsa probun saç tokası seklindeki yapısı değişmeyeceğinden ortamda hedef DNA dizisi bulunsa bile floresan ışıma elde edilemeyebilir. Hibridizasyon Prob Yöntemi; Roche tarafından “LightCycler®” PCR cihazında kullanılmak üzere geliştirilmiştir. İki farklı prob dizayn edilmiştir. 3’ ucunda floresans işaretli boya (donor), 5′ ucunda ise alıcı boya (acceptor) bulunmaktadır.

Samet Cırık
Nur Kazan

KAYNAKÇA


Gen Anlatımının Kantitatif Analizi “Real-Time PCR”. QUANTITATIVE ANALYSIS OF GENE EXPRESSION “REAL-TIME PCR”: SCIENTIFIC LETTER. Dr. Tuba GÜNEL. Turkiye Klinikleri J Med Sci 2007, 27:763-767

106

Samet CIRIK

Genel Yayın Yönetmeni Sakarya Üniversitesi Tıp Fakültesi/Tıp

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir