PCR-2- PCR’IN TEMEL ELEMANLARI

PCR-2- PCR’IN TEMEL ELEMANLARI

Bir önceki yazıda PCR’ın temel mantığı ve çalışma prensibinden bahsetmiştik. Bu bölümde hedeflediğimiz geni çoğaltmak için temel PCR kuyusunun içinde hangi maddelerin olması gerektiğine odaklanacağız.
Normal bir PCR kuyusunun içinde; çift iplikli DNA örneği(cDNA), DNA Polimeraz, Primerler, kofaktör(MgCI2), dNTPs, Buffer(Tampon) ve dH2O bulunur. Şimdi bu malzemeleri daha yakından tanıyalım:

cDNA:

Öncelikle şunu tekrar belirtelim; PCR cihazı sayesinde bir genin hücre içerisinde ne kadar çok eksprese edildiğini belirliyoruz. Ancak PCR cihazında doğrudan çekirdekteki DNA çoğaltılmaz. Şöyle ki, hücre içerisinde bir gen ne kadar çok ifade ediliyorsa o hücrede o kadar çok mRNA’nın bulunması gerekir. mRNA’lar PCR’da çoğaltılmak için uygun olmadıklarından PCR çalışmadan önce mRNA’dan revers transkriptaz enzimi aracılığıyla complementeryDNA(cDNA) sentezlenir. Bunun için önce hücrelerden RNA Ekstraksiyonu adı verilen bir yöntem ile RNA’lar elde edilir, daha sonra cDNA sentezi denilen ikinci bir yöntemle mRNA’dan cDNA sentezlenir. Elde edilen cDNA’lar artık PCR’da çoğaltılabilir. Bu iki tekniği daha sonra farklı yazılarımızda konuşacağız.

Not: cDNA sentezinde mRNA’dan elde edilen DNA, tek zincirlidir. Tek zincirli cDNA, PCR deneyine alındıktan sonra cihaz, döngüleri başlatmadan önce yaklaşık 15-60 saniye kadar belirli bir sıcaklıkta bekler. Döngü öncesi bu dönemde cDNA kendini eşler ve çift zincirli olarak döngüye girer.

DNA Polimeraz:

Polimerazlar kalıp olarak kullandıkları ipliğe, tamamlayıcı DNA ipliği meydana getiren enzimlerdir. Bu enzimlerin tamamlayıcı DNA zinciri yapmaları için rehber olarak kabul ettikleri primerlere ihtiyaçları vardır. Bunun için kalıp ipliğin 3’ ucuna bağlanmış primerin 3’ hidroksil ucuna her seferinde nükleofilik etki ile gelen deoksirübonükleozid trifosfatların (dNTP) fosfodiester bağlarının katalizini ve DNA polimerizasyonunu sağlarlar.

PCR ilk keşfedildiğinde E.Coli’den elde edilen DNA Polimeraz I enziminin klanow parçası kullanılıyordu. Ancak enzimin, ısı stabil olmaması nedeniyle her döngüde yeniden eklenmesi gerekiyordu.

Daha sonraları Thermus aquaticus (Taq)’dan elde edilen Taq polimeraz enzimi keşfedildi ve ısı stabil(ısıya dayanıklı) olan bu enzim yüksek polimerasyon oranı (processivity) ile klinik ve araştırma laboratuvarlarındaki rutin çalışmaları teknolojik olarak hızlandırdı. Doğal/Rekombinant termostabil DNA Polimerazların bu özellikleri sayesinde sadece amplifikasyon öncesi deney tüpüne konulması yeterli olmaktadır. Özellikle Taq polimeraz ve rekombinant olarak modifiye bir formu olan AmpliTaq™ bir yandan zinciri uzatırken diğer yandan zincirin uzayan ucundan kesim yapabilecek 5’→3’ endonükleaz aktivitesine sahiptir. Bu sayede ilgili kısım çoğaltıldıktan sonra polimeraz etkinliği durmaktadır.

Bunun dışında faststart polimeraz, Taq polimeraza benzemekle birlikte düşük sıcaklıklarda aktive olmamaktadır. Böylece non-spesifik bağlanma olmamaktadır.

Pyrococcus furiosus’dan elde edilen Pfu polimeraz, Taq polimeraza göre termostabilitesi daha hassastır. Bu enzimin sadece 5’→3’ değil aynı zamanda 3’→5’ endonükleaz aktiviteside vardır. 3’→5’ endonükleaz aktivitesi özellikle yanlış baz eşleşmelerinin önüne geçtiğinden Taq polimeraza göre 5-15 kat daha hassastır. Fakat 3’→5’ endonükleaz aktivitesi primerlerin yok edilmesi gibi bir sorunu da meydana getirmiş oluyor. Bu sorunu ortadan kaldırmak için enzim reaksiyona en son eklenmeli ve 3’ fosfotioat içeren primerler kullanılmalıdır.

dNTPs:

Amplifikasyon süresince kopyalanan gen bölgesi artıkça, yeni zincirlerin sentezi için ortamda serbest Adenin, Guanin, Sitozin ve Timin nükleotidleri bulunmalıdır. Bu nükleotitlerin in vivo ortamda uzayan bir zincirde kullanılan formu dNTP olarak isimlendirilmektedir ve bir DNA ipliği sentezinde kullanılacak dNTP’ler; dATP,dTTP,dGTP,dCTP olmak üzere dört çeşittir. PCR’ın olmazsa olmaz bu kompanentleri reaksiyon tüpünde eşit konsantrasyonlarda bulunmalıdır.

dNTP’lerin miktarları oldukça önemlidir. Mümkün olan en küçük hacimlerde kullanılmalıdır. Fazla miktarda dNTPs, ortamdaki kofaktörü çöktürebilir ve bu durum, yanlış sonuç almamıza neden olabilir.

Primerler:

Primerler çoğaltılması istenen nükleik asit zincirinin uzamasını sağlar. İlgili nükleik asit parçasının çoğaltılması için polimerazın bir başlangıç kısmına ihtiyacı vardır. Reverse ve Forward primerleri çift zincirli nükleik (DNA veya cDNA) asitin her iki ucunda da bulunan 3’OH ucuna bağlanarak polimerazın buradan yeni zinciri sentezlemesine olanak sağlar.

Genel olarak kullanılan kalıp ile primer arasında yüksek oranda bağlanma sağlamak için primerlerin yaklaşık 20-30 nükleotit uzunluğunda olması gerekir. Oligonükleotit primerler, primer sentezi yapan laboratuvarlardan ya da ticari firmalardan elde edilebilir. Primer tasarımı yaparken çoğaltılması istenilen DNA dizisinin iki ucundaki dizisi bilinen kısımlar dikkate alınır. Bu bölgelere tamamlayıcı olan primerler tasarlanır. Primer tasarımı yapmak için bilgisayar programları da geliştirilmiş olmakla beraber çoğu zaman araştırıcılar ilgilendikleri genleri ya da DNA parçalarını çoğaltmak için kendileri de primer tasarımı yapabilirler. Tasarım yapılırken mümkün olduğunca dört bazın eşit sayıda kullanımına dikkat edilmelidir. Ayrıca önem verilmesi gereken bir diğer hususta primerlerin polipürin, poliprimidin ya da tekrarlı bölgeler içermemesi ve primer çiftlerinin 3’ uçlarının birbirine ya da primer içindeki bir bölgeyi tamamlayıcı olmamasıdır. Aksi halde primer içerisinde dimerleşmeler olacağından hem istenilen bölgenin amplifikasyonunda sıkıntılar yaşatacak hem de PCR temelli bazı yöntemlerde dataların hatalı sonuçlarına neden olacaktır.

PCR temelli yöntemlerde primerin bağlanıp ilgili bölgeyi çoğaltmasının tespiti ve nicel analizinde primer vasıtasıyla ortama eklenen ışıma özelliğindeki  kemilünenesans (ışıma veren) maddeler kullanılır. Bunlar primere eklenebileceği gibi primerin nükleik asit dizisi ile oluşturacağı çift zincirli olukların arasına girebilen boyalarda olabilir (bir sonraki yazımızda değineceğiz).

Kofaktör(MgCI2):

Temel olarak PCR reaksiyonunun işleyişini düzenlerler. Ortamdaki enzimin substrat bütünlüğünün sağlanması için elzemdir. Miktarı önemlidir. Ortamdaki MgCI2 istenilenden az olması ürün oluşumun normalden az, fazla olması ise  non-spesifik bağlanmalara (hedef gen haricinde bir gen bölgesinin çoğaltılmasına) neden olacaktır.   

dH2O:

PCR’da pozitif ve negatif kontrollerde dahil tüm kuyuların eşit hacimde olması gerekir. Bu nedenle bütün malzemeler kuyuların içine konulduktan sonra hacimleri deiyonize su (dH2O) ile eşitlenir. PCR reaksiyonunda su aynı zamanda reaksiyonda görevli enzimlerin etkinliği açısından da önemlidir.

Neyse ki tüm bu malzemeleri tek tek kuyulara koymak zorunda değiliz. Şöyle düşünelim, yapacağımız deneyde cDNA ve Primer dışında diğer malzemeler her deney için standarttır. Dolayısıyla, içinde polimeraz, dNTPs, kofaktör bulunan buffer karışımları vardır. Ticari firmaların ürettiği kitler içerisinde gelen bu mixler bir PCR çalışmasını oldukça basite indirger ve deneyin optimizasyonunu kuvvetlendirir.

Malzemeleri kuyulara dağıttığımıza göre artık genlerimizi çoğaltabiliriz. Gelin bir sonraki yazıda bunu konuşalım.

Samet Cırık

Nur KAZAN

119

Samet CIRIK

Genel Yayın Yönetmeni Sakarya Üniversitesi Tıp Fakültesi/Tıp

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir