PCR-1PCR’ın Temel Mekanizması

PCR-1- “PCR’ın Temel Mekanizması”

1985 yılında keşfedilen PCR cihazı, bilimsel camiada yarattığı manevra ile sahibi Kary Mullis’e nobel ödülü kazandırdı. Zamanla geliştirilerek farklı versiyonları optimize edilmiş olan bu teknik, o zamana kadar hakkında çok az şey bilinen DNA’nın sırlarını keşfetme çalışmalarını daha da kolaylaştırdı. Öyle ki bugün itibariyle hastane laboratuvarlarında tanı için kullanımından bilimsel araştırmalarda gen ifadesinin değerlendirilmesine kadar birçok alanda yaygın olarak yerini aldı PCR cihazı.

Bu teknik sayesinde idrar, tükürük ve diğer vücut sıvılarından bakteri veya virüslerin tespitini yapabiliyor, doku ve hücrede bulunan genetik materyali çoğaltabiliyor, bunun yanı sıra çoğaltılan örnekler ile hastalıklar arasındaki ilişkiyi sağlıklı bir şekilde ortaya koyabiliyoruz. Bu yazı serisinde başta temel mekanizması olmak üzere, PCR’ın teknik ve detay kısımlarına kadar inip bilimsel ve laboratuvar çalışmalarında hangi süreç ve prosedürlerin uygulandığını sırasıyla sizlerle paylaşacağız.

Bu seri şu başlıklardan oluşacaktır:

1-PCR’ın Temel Mekanizması

2-PCR’ın Temel Elemanları 

3-PCR Çeşitleri

4-PCR ile Doğru Materyalin Çoğaltılması

Dört farklı yazıdan oluşacak bu seride önce birinci kısmı konuşalım:

PCR’ın Temel Mekanizması

Polimeraz Zincirleme Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction) veya kısa adıyla PCR, genetik materyalimiz olan DNA’nın iki zinciri bilinen kısımlarının çoğaltılmasını sağlayan in vitro bir tepkime olarak tanımlanabilir. Bilindiği üzere DNA, nükleik asitlerden oluşmuş çift sarmal bir yapıya sahiptir. Canlıların bütün genetik bilgisinin taşındığı bu çift sarmallı yapı, hücre bölündükçe kendini kopyalayıp varlığını nesiller boyunca garantiye alarak bir hücrenin yaşamı boyunca ihtiyaç duyacağı proteinlerin sentezlenmesine olanak sağlar.

Hücre bölünme emrini aldığında DNA, önce kademeli olarak çift sarmallı yapısını açar, sonra her bir zincir, sentezde görev alan ilgili enzimler yardımıyla kendinin komplementerini oluşturur. Böylece eşlenen zincirler birbirinin aynı iki DNA molekülünü meydana getirmiş olur.

Canlı içerisinde in vivo olarak gerçekleşen bu döngüyü PCR cihazları sayesinde laboratuvar ortamında da gerçekleştirebiliyoruz. Şöyle ki, PCR cihazı, içerisine yerleştirdiğimiz deney kuyusunun sıcaklığını farklı zamanlarda ve belirlenen değer aralıklarında değiştirerek DNA’nın çift sarmal yapısının çözünmesine, zincirlerinin birbirlerinden ayrılmasına ve DNA polimeraz enzimi sayesinde ayrılmış zincirlerin karşısına gelen yeni zincirinin uzamasına olanak sağlıyor. Basit bir şekilde sıcaklık ayarını değiştirerek DNA’nın kendini kopyalamasını sağlayan bu olay bir döngü olarak adlandırılır. Bu döngü defalarca kez tekrarlanarak istediğimiz genetik materyali veya spesifik gen bölgesini teorik olarak sonsuz kez çoğaltabiliyoruz.

Peki bu mekanizmanın ana prensibi nedir? Bu yazımızda giriş mahiyetinde DNA’nın yapısını ve PCR’ın temel mekanizmasını konuşalım, sonra ki yazılarımızda ise bu tekniğin detay kısımlarına ve laboratuvar protokolüne geçeceğiz.

DNA’nın yapısı:

DNA, başlıca nükleotid denilen kısa parçaların, fosfat omurgada alt alta sıralanarak oluşturduğu iki zincirden ve bu iki zincirin birbirine hidrojen bağlarıyla bağlanarak sarmal bir form almasıyla meydana gelen bir makromoleküldür. Nükleotidler üç farklı birimden meydana gelmiş yapılardır. Şekilde de göreceğiniz gibi nükleotidler; ortasında beş karbonlu şekerden, bu şekerin beşinci karbon atomuna bağlanmış fosfat gurubundan ve birinci karbon atomuna bağlı bir azotlu organik bazdan oluşmuştur. Bu yapılar tek bir zincirde sıralanmış olup her biri şekerinin üçüncü karbonu ile bir alt sıradaki nükleotidin fosfat gurubuna bağlanarak DNA’nın iskeletini oluşturur. Burada nükleotidleri birbirinden farklı kılan durum, azotlu organik bazlardır. DNA molekülü için dört farklı organik baz bulunmaktadır; adenin, guanin, sitozin ve timin. Bundan dolayı dört farklı nükleotidden bahsederiz. Bu dört farklı nükleotid genetik haritada yer alan belirli bir konfigürasyonda dizilerek birinci zinciri oluşturur. Bu zincire kalıp zincir diyebiliriz.

Şimdi kalıp zincire göre karşı zinciri oluşturmamız gerekiyor. Karşılıklı gelen zincirlerde nükleotidlerin uyumu çok önemlidir. Bir zincirde yer alan adenin nükleotidinin karşısına timin, guanin nükleotidinin karşısında ise sitozin nükleotidi gelir. Ancak nükleotidlerin sırasıyla dizilmesi için bir yardımcıya ihtiyaç duyarız. Şüphesiz o yardımcı bir enzim olan DNA polimeraz’dır. İkinci zincir ortamda bulunan nükleotidler kullanılarak DNA polimeraz tarafından sentezlendikten sonra, zincirler birbirine hidrojen bağlarıyla bağlanır ve kendine has lineer yapısı ile uzaysal konumunu kazanır. Yer tasarrufu açısından önemli olan bu sarmal yapı, sarmal yapısını oluştururken minör ve majör oluklar oluşturur. Bunu söylüyoruz çünkü PCR’ın detayına inerken buraya bir atıf yapacağız.

Bir deney kurgusunda PCR yapacaksak ilgili materyali doğru tanımak hem PCR’dan doğru sonuç almak hem de deneyden alacağımız sonuçların doğru değerlendirilmesi açısından önemli olacaktır. Şimdi hücre içerisinde gerçekleşen bu olayı PCR cihazı hangi mekanizma ile yapıyor, ona bakalım:

PCR Temel Mantığı:

DNA’nın in vitro ortamda yani PCR cihazına yerleştirdiğimiz kuyunun içinde çoğalabilmesi başlıca üç temel aşama sayesinde gerçekleşir. Bunlar;

1-Denatürasyon

2-Bağlanma(Annealing)

3-Uzama(Elongation)

1-Denatürasyon(94-96C, 15-60 sn):

Bu basamakta cihaz, kuyunun sıcaklığını 94-96 dereceye kadar çıkarır. Bu değerlerde PCR’da kullanılan termostabil DNA polimeraz dahil bütün enzimatik reaksiyonlar durur. Çift zincir arasındaki hidrojen bağları kopar ve zincirler birbirinden uzaklaşır. Buna denatürasyon denir. Bu işlem her döngü için yaklaşık 15-60 saniye kadardır. Sadece ilk döngü çift zincirin tamamen denatüre olması, olası kontaminasyonların elimine edilmesi ve diğer enzimatik faktörlerin bloke olması açısından 15 dakikaya kadar uzayabilmektedir.

2-Bağlanma/Annealing(47-60C, 30-60 sn):

Denatürasyonun ardından birbirinden ayrılan ipliklerin uzaması için primer adı verilen yaklaşık 18 bazlık nükleotid dizisinden oluşan diziler, belirlenen sıcaklık değerinde istediğimiz gen bölgesinin başına bağlanır. Bu aşamada sıcaklık değerinin primerimize göre hesaplanması bir sonraki aşama olan uzamanın sağlıklı gerçekleşebilmesi için elzemdir. Primer için optimize edilmiş bu sıcaklık değerine Melting Temperature (Tm) ya da erime sıcaklığı adı verilir.

3-Uzama/Elongation(72C, 1-10 dk):

Son aşama olan bu kısımda cihaz, ortamın sıcaklığını 72 dereceye kadar yükseltir. Bu sıcaklık değerinde kuyunun içinde önceden bulunan DNA polimeraz enzimi aktif olarak bağlanmış primerlerden başlayıp kalıp zincirin komplementerini sentezlemeye başlar. Bu basamak, kullanılan polimeraz çeşidine, çoğaltılmak istenen genin büyüklüğüne ve kaynağına göre 3-10 dakika arasında sürer. Bu aşamanın sonunda birbirinin aynısı olan iki adet çift zincirli DNA elde edilmiş olur.

PCR cihazı, üç basamaktan oluşan bu döngüyü defalarca tekrarlayarak ilgili DNA miktarının her döngüde bir önceki döngüye göre iki katına çıkmasını sağlamış olur. Dolayısıyla döngü sayısı arttıkça DNA miktarına bağlı olarak ilgili genin ifadesi de logaritmik olarak arttırılmış olur.

Klasik PCR cihazlarında DNA miktarına bakılmaksızın –örneğimiz eser miktarda olsa dahi- bu döngüler ile DNA ve ilgili genler çoğaltılır ve sonrasında elde edilen genler jel elektroferezde yürütülerek ayrıştırılıp ve kullanılabilir. Ancak günümüzde sıklıkla tanıda ve bilimsel araştırmalarda kullanılan bir PCR çeşiti olan RT-PCR’dan elde edilen veriler ışığında gen ifadesinin tayini nicel olarak ifade edilebilir. Böylelikle ifadesi artan genlerin ilişkisi sayısal olarak ortaya konulmuş olur. Ne demek genlerin ifade edilmesi? Bu sayısal değerler ne anlama geliyor? Genin çoğaldığını nasıl anlayabiliyoruz? Hadi gelin bir sonraki yazımızda detaylı olarak bunları konuşalım.

Samet Cırık
Nur Kazan

KAYNAKÇA


1- Julia, B. 2013. “Reverse-transcription PCR (RT-PCR)”. Methods in Enzimology. doi: 10.1016/B978-0-12-420037-1.00002-6.

2- Kelvin, L., Anushka, B. 2010. “Primer design for RT-PCR”. Methods in Molecular Biyology. doi: 10.1007/978-1-60761-629-0_18.

3- Alexander, A., M., 2014. “Digital PCR: A brief history”. Biomolecular Detection and Quantification. doi: 10.1016/j.bdq.2014.06.001.

4- Michael, R., G., Joseph, S., 2018. “Touchdown Polymerase Chain Reaction (PCR)”. Cold Spring Harbor Protocol.  doi: 10.1101/pdb.prot095133.

5- Hanliang, Z., Haoqing, Z., Ying, X., Soňa, L., Marie, K., Pavel, N. 2020. “PCR past, present and future”. BioTecniques. doi: 10.2144/btn-2020-0057.

6- Michael, R., G., Joseph, S. 2018. “The Basic Polymerase Chain Reaction (PCR)”. Cold Spring Harbor Protocol. doi: 10.1101/pdb.prot095117.

230

Samet CIRIK

Genel Yayın Yönetmeni Sakarya Üniversitesi Tıp Fakültesi/Tıp

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir